高效液相色譜儀(HPLC)是運(yùn)用高效液相色譜原理，首要用于剖析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機(jī)化合物的儀器設(shè)備。它由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的活動(dòng)相被高壓泵打入體系，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入活動(dòng)相，被活動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)，因?yàn)闃悠啡芤褐械母鹘M分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配進(jìn)程，各組分在移動(dòng)速度上發(fā)生較大的不同，被別離成單個(gè)組分順次從柱內(nèi)流出，經(jīng)過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜方法打印出來(lái)。HPLC廣泛運(yùn)用于生命科學(xué)、食品科學(xué)、藥物研討以及環(huán)境研討中。

原理

儲(chǔ)液器中的活動(dòng)相被高壓泵打入檢測(cè)體系，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入活動(dòng)相，被活動(dòng)相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，因?yàn)闃颖救芤褐械母鹘M分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的“吸附-解吸”的分配進(jìn)程，各組分在移動(dòng)速度上發(fā)生較大的不同，被別離成單個(gè)組分順次從柱內(nèi)流出，經(jīng)過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣本濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜方法輸出檢測(cè)成果。

依據(jù)別離機(jī)制的不同，HPLC原理可分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交流色譜法及分子排阻色譜法。

1. 液固吸附色譜法

液固吸附色譜法中，固定相為固體吸附劑，依據(jù)各組分吸附才能差異而使組分得以別離。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，大多數(shù)用于非離子型化合物。吸附色譜固定相能夠分為極性和非極性兩大類。對(duì)活動(dòng)相的要求為：

1) 選用的溶劑應(yīng)當(dāng)與固定彼此不相溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性。

2) 選用的溶劑應(yīng)有高純度，以防所含微量雜質(zhì)在柱中堆集，引起柱功用的改動(dòng)。

3) 選用的溶劑功用應(yīng)與所運(yùn)用的檢測(cè)器相匹配，如果運(yùn)用紫外吸收檢測(cè)器，就不能選用在檢測(cè)波長(zhǎng)下有紫外吸收的溶劑；若運(yùn)用示差折光檢測(cè)器，就不能用梯度洗脫。

4) 選用的溶劑應(yīng)對(duì)樣品有足夠的溶解才能，以進(jìn)步測(cè)定的靈敏度。

5) 選用的溶劑應(yīng)具有低的黏度和恰當(dāng)?shù)偷姆悬c(diǎn)。

6) 應(yīng)盡量避免運(yùn)用具有顯著毒性的溶劑，以保證工作人員的安全。

液固色譜法是以外表吸附功用力為依據(jù)的，所以它常用于別離極性不同的化合物，也能別離那些具有相同極性基團(tuán)，但數(shù)量不同的樣品。

2. 液液分配色譜法

固定相為液體，依據(jù)被別離的組分在活動(dòng)相和固定相中的溶解度不同而別離。依固定相和活動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法和反相色譜法。正相色譜法選用極性固定相，活動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑，常用于別離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物；反相色譜法一般用非極性固定相，活動(dòng)相為水或緩沖溶液，適用于別離非極性和極性較弱的化合物。其間，反相色譜運(yùn)用*廣。

3. 離子交流色譜法

固定相是離子交流樹(shù)脂。樹(shù)脂上可電離離子與活動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行交流，依據(jù)各離子與離子交流基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而別離。

4. 分子排阻色譜法

分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，它是依照分子尺度大小順序進(jìn)行別離的一種色譜辦法。分子排阻色譜法的固定相凝膠是一種多孔性的聚合資料，有必定的形狀和穩(wěn)定性，運(yùn)用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻才能的差異而完結(jié)別離。依據(jù)所用活動(dòng)相的不同，凝膠色譜法能夠分為兩類：即用水溶劑做活動(dòng)相的凝膠過(guò)濾色譜法(GFC)與用有機(jī)溶劑如四氫呋喃做活動(dòng)相的凝膠滲透色譜法(GPC)。

延伸

在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中停留時(shí)間長(zhǎng)，后流出色譜柱；K值小的組分則停留時(shí)間短，先流出色譜柱�；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越簡(jiǎn)單別離，因而混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜別離的前提。

在HPLC中，固定相確定后，K首要受活動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中首要靠調(diào)整活動(dòng)相的組成配比及pH值，以取得組分間的分配系數(shù)差異及適合的保存時(shí)間，達(dá)到別離的目的。

色譜

（high performance liquid chromatography,HPLC）也叫高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography）、高速液相色譜（high speed liquid chromatography）、高別離度液相色譜（high resolution liquid chromatography）等或Efficient liquid chromatographyspectrometry。是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而敏捷發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓運(yùn)送活動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜。又因剖析速度快而稱為高速液相色譜。

高效液相色譜是運(yùn)用*多的色譜剖析辦法，高效液相色譜體系由活動(dòng)相儲(chǔ)液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和記錄器組成，其全體組成類似于氣相色譜，可是針對(duì)其活動(dòng)相為液體的特點(diǎn)作出許多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn)；進(jìn)樣體系要求進(jìn)樣便當(dāng)切換嚴(yán)密；因?yàn)橐后w活動(dòng)相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長(zhǎng)度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。HPLC運(yùn)用十分廣泛，幾乎遍及定量定性剖析的各個(gè)領(lǐng)域。

運(yùn)用高效液相色譜時(shí)，液體待檢測(cè)物被注入色譜柱，經(jīng)過(guò)壓力在固定相中移動(dòng)，因?yàn)楸粶y(cè)物種不同物質(zhì)與固定相的彼此作用不同，不同的物質(zhì)順序離開(kāi)色譜柱，經(jīng)過(guò)檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào)，*后經(jīng)過(guò)剖析比對(duì)這些信號(hào)來(lái)判斷待測(cè)物所含有的物質(zhì)。高效液相色譜作為一種重要的剖析辦法，廣泛的運(yùn)用于化學(xué)和生化剖析中。高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒(méi)有實(shí)質(zhì)的不同，它的特點(diǎn)是選用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)器和高效微粒固定相，適于剖析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物。

結(jié)構(gòu)及功用

HPLC儀一般由溶劑運(yùn)送體系、進(jìn)樣體系、別離體系（色譜柱）、檢測(cè)體系和數(shù)據(jù)處理與記錄體系組成，詳細(xì)包括儲(chǔ)液器、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀或數(shù)據(jù)工作站等幾部分。其間輸液泵、色譜柱和檢測(cè)器是HPLC儀的關(guān)鍵部分。

1. 溶劑運(yùn)送體系

儲(chǔ)液器：用來(lái)貯存數(shù)量足夠、符合要求的活動(dòng)相。配有溶劑過(guò)濾器，以避免活動(dòng)相中的顆粒進(jìn)入泵內(nèi)。

脫氣器：脫氣的目的是為了避免活動(dòng)相從色譜柱內(nèi)流出時(shí)釋放出氣泡進(jìn)入檢測(cè)器，然后引起噪聲，不能正常檢測(cè)。

輸液泵：將儲(chǔ)液器中的活動(dòng)相連續(xù)不斷地以高壓方法進(jìn)入液路體系，使樣品在色譜柱中完結(jié)別離進(jìn)程。

梯度洗脫設(shè)備：是在別離進(jìn)程中經(jīng)過(guò)逐漸改動(dòng)活動(dòng)相的組成添加洗脫才能的一種設(shè)備。

2. 進(jìn)樣體系

進(jìn)樣器：是將樣品送入色譜柱的設(shè)備，進(jìn)樣方法能夠分為兩種：閥進(jìn)樣或自動(dòng)進(jìn)樣。比較常用的是選用自動(dòng)進(jìn)樣器裝樣。

3. 別離體系

色譜柱：對(duì)樣品進(jìn)行別離，是整個(gè)色譜體系的心臟，它的質(zhì)量好壞直接影響到別離的作用。

4. 檢測(cè)體系

檢測(cè)器：將色譜柱連續(xù)流出的樣品組分轉(zhuǎn)變成易于測(cè)量的電信號(hào)，被數(shù)據(jù)體系接收，得到樣品別離的色譜圖。

5. 數(shù)據(jù)處理和記錄體系

對(duì)色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并參加HPLC儀器的自動(dòng)控制。